一、 取材
1. 注意事项：预冷PBS,提前放入4℃冰箱1-2小时；4%PFA用1XPBS配制，通风橱恒温加热搅拌；灌流时尽可能灌流干净，洗净组织中的残留血液。
2. 步骤：
1) 1XPBS灌流
2) 内固定：灌流4%PFA
3) 外固定：将组织放入4%PFA溶液中48h-72h
4) 沉糖：30%蔗糖（组织沉底可切）
二、 冰冻切片
1. 注意事项：底座预冷10Min；涂OCT，切除小脑便于粘在底座上；全脑涂OCT,切片机冻大于2h，冰箱-20过夜；切片机提前预冷。
三、 免疫荧光染色
1. -20℃冰箱取片，室温晾干15min（复温）；
2. PBS洗三次，每次5min
3. 抗原修复（可选步骤），5min 95℃水浴
4. 透膜 0.3%TritonX-100 5-10min (100mlPBS+0.3mL TritonX-100)
5. PBS洗3次
6. 封闭 ：组化笔圈组织，5%BSA或5-10%FBS封闭1h(室温)，37℃30min.
7. 擦干封闭液
8. 滴加一抗，4℃过夜（湿盒），一般16小时
第二天
9. 漂洗：PBS漂洗3次，每次10min
10. 敷二抗：稀释比例一般1:500，室温孵育2h,注意避光；也可37℃ 1小时
11. 漂洗：PBS洗3次，每次5min
12. 擦干，抗荧光淬灭封片液封片
四、 注意事项
1. TritonX-100配好后4℃保存可放很久
2. 冰箱-20℃取出后尽量不要太干
3. 染色过程尽量不要干片
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